分化コントロール化合物を用いて造腫瘍性をもつおそれのある未分化ｉＰＳ細胞等の混入を除去する方法

• 特願2018-064199 (2018.3.29) JP

• 中島 義基
• 大政 健史
• 野口 洋文
• 潮平 知佳

• 国立大学法人琉球大学

人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多分化能幹細胞を用いる再生医療技術の課題のひとつは、多分化能幹細胞を所望のタイプの細胞に分化させた後に患者の体内に移植する際に、多分化能幹細胞が未分化状態のまま残存し、分化した細胞とともに患者の体内に移植され、患者の体内で腫瘍及び癌化する危険を如何に防止するかである（非特許文献１参照）。

造腫瘍性をもつおそれのある未分化ｉＰＳ細胞等の混入を評価する試験系としては、未分化多能性細胞特異的なマーカーや分化能の高い細胞に特異的なマーカー（非特許文献２参照）の発現を指標にしたフローサイトメトリー解析や定量的ＲＴ-ＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）法が挙げられる。しかし、いずれも一定の頻度以下の未分化多能性幹細胞の混入は検出できない。そのため、最終製品の安全性評価には、未分化多能性幹細胞を培養条件に戻して培養してｉＰＳ細胞等のコロニーが出現しないことの確認などが必要である。

化学分子データベースPubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)から、Liarozoleの試薬名や化学式は提示可能である。Liarozole(6-[(3-chlorophenyl)-imidazol-1-ylmethyl]-1～{H}-benzimidazole、化１参照)は、シトクロムP450RAI（retinoic acid inducible＝レチノイン酸誘導性）酵素阻害薬の一種である。

【化１】
（省略）

シトクロムP450RAI阻害剤は、現在、ケトコナゾール（Ketoconazole）、リアロゾール（Liarozole）およびＲ１１６０１０、さらに、シクロプロピルアリール、シクロプロピルヘテロアリール、シクロプロピルアミノアリール、または（１-イミダゾリル）メチルアリール構造を持つ酵素シトクロムP450RAIに対して阻害作用を持ついくつかの化合物が知られている（特許文献１参照）。先行技術では、ヒトを含む哺乳動物にある種のシトクロムP450RAI阻害剤を投与すると内因性ＲＡレベルの有意な増加が起こること、そしてシトクロムP450RAI阻害剤、例えばリアロゾールによる処置は、レチノイドによる処置と類似する効果、例えば乾癬の改善をもたらすことが指摘されている（非特許文献３参照）。

本発明に関連して、特許文献1には、レチノイドは、胚発生の期間中遺伝子発現を調節すること、および、例示的なレチノイド反応性障害（disorders than can be treated）としては、挫創等の皮膚障害、自己免疫性障害、炎症性障害、増殖性障害、神経障害、視覚障害および肺障害が挙げられており、レチノイド反応性障害を有するヒトを処置するための方法としてシトクロムP450RAI阻害剤の使用が単独かもしくはレチノイド処置と組み合わせて、個体中のレチノイドのレベルを有益に維持するかもしくは増大させる技術が開示されている。当該文献の実施例には、ハムスター腹側部器官における皮脂腺の分化についての実験において、シトクロムP450RAI阻害剤の経口強制栄養法により、皮脂腺の分化をブロックすることが記載されている。特許文献2には、シトクロムP450RAI阻害剤として作用する可能性のあるいくつかの化合物が示されている。しかし、培地添加物としてのシトクロムP450RAI阻害剤の具体的な利用方法は検討されておらず、またｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化誘導に関する具体的な事例は開示されていない。

化学分子データベースPubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)から、Pioglitazoneの試薬名や化学式は提示可能である。 Pioglitazone(5-[[4-[2-(5-ethylpyridin-2-yl)ethoxy]phenyl]methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione、化２参照）は、チアゾリジン（Thiazolidinedione）誘導体の一種である。

【化２】
（省略）

チアゾリジン誘導体とはチアゾリジンから合成される一群の化合物であり、例えば、〔〔ω-（ヘテロシクリルアミノ）アルコキシル〕ベンジル〕-２、４-チアゾリジンジオン、（±）-５-〔〔２-（２-ナフタレニルメチル）-５-ベンゾキサゾイル〕メチル〕-２、４-チアゾリジンジオン等が例示される。具体的に、インスリン抵抗性改善薬として利用されるロシグリタゾン（Rosiglitazone：グラクソ・スミスクライン）、ピオグリタゾン（Pioglitazone：武田薬品工業）、ロべグリタゾン（Lobeglitazone：Ｃｈｏｎｇ Ｋｕｎ Ｄａｎｇ）、トログリタゾン（Troglitazone：第一三共）、リボグリタゾン（Rivoglitazone：第一三共）、または、シグリタゾン（Ciglitazone：武田薬品工業）等が挙げられる。チアゾリジン誘導体は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）γ作動薬であり、脂肪組織や肝臓・骨格筋のインスリン感受性を増加させ、慢性的な高血糖を改善する。先行技術では、インスリン、トランスフェリン、デキサメタゾン、ビオチン、アスコルビン酸、グルコース、上皮成長因子若しくは繊維芽細胞成長因子、ならびに亜セレン酸若しくはその塩を含有し、かつインドメタシン、プロスタグランジン、長鎖脂肪酸およびチアゾリジン誘導体よりなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を加えた栄養培地を使用することにより、無血清あるいは低血清状態で初代前駆脂肪細胞を分化誘導することができることが指摘されている（特許文献３参照）。

本発明に関連して、特許文献４には、非ステロイド性抗炎症剤またはチアゾリジン誘導体が骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍または軟骨肉腫のＰＰＡＲγの発現を誘導し、それによってアポトーシスまたは脂肪細胞分化を誘導することで骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍または軟骨肉腫の予防または治療剤として利用可能とするためのスクリーニング方法が記載されている。しかし、特許文献４には、培地添加物としてのPioglitazoneの具体的な利用方法は検討されておらず、またｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化誘導に関する具体的な事例は開示されていない。

化学分子データベースPubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)から、Silibinin(Silybin)の試薬名や化学式は提示可能である。 Silibinin(Silybin)（(2～{R},3～{R})-3,5,7-trihydroxy-2-[(2～{R},3～{R})-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydrochromen-4-one、化３参照）は、マリアアザミ（Silybum marianum）種子の標準化された抽出物であるシリマリン（Silymarin）の主要な活性成分である。

【化３】
（省略）

シリマリンには、シリビニン（silibinin）、シリジアニン（silydianin）、イソシリビン（isosilybin）、シリクリスチン（silychristin）などがある。シリマリンには、グルコ-スの取り込みの阻害作用、低酸素誘導因子（HIF）活性の阻害作用、PI3/Akt/mTORシグナル伝達系の阻害作用など、複数の機序で癌細胞のワールブルグ効果を阻害する作用が報告されている（非特許文献４参照）。

本発明に関連して、特許文献５には、シリマリンは、哺乳類の眼の角膜及び／又は強膜を通じた眼科用の浸透促進剤、浸透増進剤、吸収増進剤の機能成分として用いられ、角膜上皮細胞の再生に対しても使用例が上げられている。特許文献６には、シリマリンは、加齢及び免疫老化に関係する病気の治療目的として造血幹細胞の機能低下、及び、抗癌効果を目的とした栄養補助食品としての利用例が上げられている。しかし、培地添加物としてのシリマリンの具体的な利用方法は検討されておらず、またｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化誘導に関する具体的な事例は開示されていない。

化学分子データベースPubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)から、Chrysinの試薬名や化学式は提示可能である。 Chrysin（5,7-dihydroxy-2-phenylchromen-4-one、化４参照）は、果実の果皮、トケイソウやプロポリスなどに含まれるフラボノイドの一つである。また、プロポリスの主要な活性成分として知られる。

【化４】
（省略）

クリシンには、COX-2遺伝子やプロスタグランジンE2の阻害作用など抗炎症作用（非特許文献５参照）、低酸素誘導因子（HIF）活性の阻害作用（非特許文献６参照）が報告されている。

本発明に関連して、非特許文献７において、クリシンは、ヒト癌細胞に対する増殖抑制作用を有し、特に白血病に関連した癌細胞株には他のフラボノイドと比較して特に強いアポトーシスの誘導効果があることが開示されている。また、同効果の作用機序にAktシグナル伝達の阻害が関与することが報告されている（非特許文献７参照）。しかし、培地添加物としてのクリシンの具体的な利用方法は検討されておらず、またｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化誘導に関する具体的な事例は開示されていない。

本発明は、幹細胞由来の分化細胞用培地、幹細胞からの分化細胞の製造及び該分化細胞を含む細胞医薬組成物の製造のための方法に関する。より詳しくは、特に心筋細胞に好適に用いられる分化コントロール化合物（Liarozole、Pioglitazone、Silibinin、Chrysin）によって幹細胞の生存を抑制して目的とする分化細胞のみを選択的に培養可能な培地等に関する。

• C12N   5/077     間葉細胞，例．骨細胞，軟骨細胞，骨髄間質細胞，脂肪細胞または筋肉細胞
• A61P  43/00      グループＡ６１Ｐ１／００～Ａ６１Ｐ４１／００に展開されていない特殊な目的の医薬
• A61L  27/38      動物細胞
• A61K  35/12      哺乳動物からの物質；特定されていない組織または細胞からなる組成物；非胚性幹細胞からなる組成物；遺伝子的に修飾された細胞
• A61P  35/00      抗腫瘍剤
• A61K  35/545     胚性幹細胞；多能性幹細胞；人工多能性幹細胞，すなわち，ｉＰＳ細胞；特徴づけられていない幹細胞
• A61K  35/34      筋肉；平滑筋細胞；心臓；心筋幹細胞；筋芽細胞；筋細胞；心筋細胞
• A61L  27/54      生物学的活性を有する材料，例．治療用物質
• A61K  31/4184    炭素環と縮合したもの，例．ベンズイミダゾール
• A61K  31/4439    環異種原子として室素を有する５員環を含むもの，例．オメプラゾール
• A61K  31/357     ２個以上の酸素原子が同一環中に有するもの，例．クラウンエーテル，グアナドレル
• A61K  31/352     炭素環と縮合したもの，例．カンナビノール，メタンテリン

• 4B065AA90 動物細胞または組織
• 4B065BB04 有機化合物
• 4B065BB06 水酸基を有するもの
• 4B065BD13 微生物の不活性化
• 4B065BD25 有機化合物
• 4B065BD27 水酸基を有するもの
• 4B065CA44 医薬（ヒト用）；医療
• 4C081AB34 人工心臓
• 4C081AB35 その他の人工臓器
• 4C081CE11 その他
• 4C081DA01 ブロック状
• 4C086AA01 医薬用途発明（クレーム中記載）
• 4C086AA02 医薬用途，薬理機作試験実施データあり
• 4C086BA08 炭素環と縮合した（図面）
• 4C086BA15 炭素環と縮合した
• 4C086BC39 炭素環と縮合した（図面）
• 4C086BC82 １，３位に含む（図面）
• 4C086GA08 ピリジン環（図面）
• 4C086GA10 同一環に硫黄原子及び窒素原子を含む複素環
• 4C086MA02 クレームに記載の配合成分が２成分のもの
• 4C086MA04 クレーム中記載成分が薬効成分のみ
• 4C086NA05 作用増強，作用選択性の改善
• 4C086ZC02 生体内生理活性物質様薬
• 4C086ZC75 共力作用を有する医薬
• 4C087AA01 クレームが医薬用途発明又は医薬製法発明
• 4C087AA02 医薬用途，薬理作用機作の試験データがある
• 4C087BB47 筋肉，心臓
• 4C087BB64 培養細胞，培養組識
• 4C087MA02 ２種以上の活性成分を含有するもの
• 4C087NA05 作用増強，作用選択性の改善
• 4C087ZA36 循環器官用薬
• 4C087ZC02 生体内生理活性物質様薬
• 4C087ZC41 機作で特定された医薬