新規Ｄ－アラビナン分解酵素

• 藤田 清貴
• 隅田 泰生

• 国立大学法人鹿児島大学
• 株式会社スディックスバイオテック

結核は、ストレプトマイシンやリファンピシリンなどの抗結核薬の登場とＢＣＧ接種の普及により制圧できると考えられてきた。しかし、発展途上国において多剤耐性結核菌の感染が増加し、日本でも２万人を超える感染者が確認されている。このため、より強力な抗結核薬を求めて、新たに、細胞壁合成・タンパク質合成・ＤＮＡ合成・ＡＴＰ合成阻害剤の開発が進められている。この中で、ヒトが持たない結核菌細胞壁成分の中で、特にリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）と呼ばれる糖脂質が創薬の重要なターゲットの一つとし注目され、ＬＡＭの生合成経路の解明とその生合成を阻害する抗結核薬の開発が進められている。

ＬＡＭは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）がマンナン鎖によって修飾された糖脂質であるリポマンナン（ＬＭ）に、Ｄ－アラビナン鎖と呼ばれるアラビノースによって修飾された構造を有する（図１）。なお、ＬＡＭに修飾されているアラビノースは、植物に見られるＬ体では無く、結核菌やらい菌などの抗酸菌特有のＤ体のフラノース型である。Ｄ－アラビナン鎖は、α１，５－結合のＤ－アラビノフラノース（Ｄ－Ａｒａｆ）で構成されたα１，５－D－アラビナン主鎖にα１，３－結合で分岐した枝分かれ構造を有している。さらにその非還元末端はβ１，２－結合のＤ－Ａｒａｆとマンノースで修飾されている。また、抗酸菌の細胞壁を構成するアラビノガラクタン鎖(ＡＧ)もＬＡＭと同様のD－アラビナン鎖で修飾されていることが知られている。なお、本明細書において「Ara」はアラビノースを表し、「f」はフラノース環構造を表す。

エンド－D－アラビナーゼとは、LAMやAGのD-アラビナン鎖に対してエンド型に作用しD－アラビノオリゴ糖を遊離させるとともに、LAMをLMに分解する酵素である。エンド－D－アラビナーゼに関する報告は、オーレオバクテリウム（Aureobacterium）に属するM２株（現在Microbacterium arabinogalactanolyticum NBRC14344として寄託されている）が分泌する天然型酵素（nＥｎｄｏ－ＭＡ）の存在が報告されている（非特許文献１）。また、その精製に関する報告が行われている（非特許文献２）。さらに、放線菌Cellulomonas属細菌からの精製に関するもの（非特許文献３）及び、非結核性抗酸菌Mycobacterium Smegmatisに菌体内酵素として存在していることを確認したものがある（非特許文献４）。しかしながら、現在までこれらのエンド－D－アラビナーゼのクローニング及び異種遺伝子発現に関する報告は行われていない。
一方、エキソ－α－D－アラビノフラノシダーゼとは、エンド－D－アラビナーゼによって遊離されたα－D－アラビノオリゴ糖に対してエキソ型に作用しD-Araを遊離する酵素である。本酵素に関してはオーレオバクテリウムM２株が生産する酵素の精製に関する報告がある（非特許文献５）。しかし、現在までエキソ－α－D－アラビノフラノシダーゼのクローニング及び異種遺伝子発現に関する報告は行われていない。なお、本明細書において酵素名の前に記載された「ｒ」は組換えタンパク質であることを表し、「ｎ」は天然型タンパク質であることを表す。

さらに、抗体作成の際に用いられる完全フロイトアジュバント(CFA：免疫動物内で抗原の放出を穏やかにすることで，強力でかつ長期間に渡り持続的な免疫応答を促進する薬剤)には加熱死菌の結核菌の類縁菌Mycobacterium butyricumが使用されている。CFAは免疫動物に炎症を引き起こす欠点があり、その代替品が必要とされている。既にLAMには免疫を活性化する能力があることが報告されており、LAMの免疫賦活能力を維持したまま低分子化することによる体内動態の最適化の可能性も指摘されている（非特許文献６）。また、ＬＭにも免疫賦活能力があることが報告されている（非特許文献７）。エンド－D－アラビナーゼとエキソ－α－D－アラビノフラノシダーゼはこの低分子化及びＬＡＭのＬＭへ分解を行うことができる酵素である。しかし、先行技術文献のうち精製工程が記載されているのは非特許文献２と３と５があるが、ここに記載の方法では精製工程も煩雑であり、夾雑物を含まない精製酵素の大量調製は困難であるという問題があった。

本発明は、新規Ｄ－アラビナン分解酵素であるエンド－Ｄ－アラビナーゼ及びエキソ－α－Ｄ－アラビノフラノシダーゼ、及びそれらの用途に関する。

• C12N  15/09      組換えＤＮＡ技術
• C12N   9/24      グリコシル化合物に作用するもの
• C12P  19/04      多糖類，すなわち６以上の糖類基がグリコシド結合によって互いに結合した化合物
• C12Q   1/34      加水分解酵素を含むもの
• C12N   1/15      外来遺伝物質の導入によって修飾されたもの
• C12N   1/19      外来遺伝物質の導入によって修飾されたもの
• C12N   1/21      外来遺伝物質の導入によって修飾されたもの
• C12N   5/10      外来遺伝物質の導入によって修飾された細胞，例．ウイルス形質転換細胞

• 4B050CC03 遺伝子組換え技術により製造されたもの
• 4B050CC07 酵素組成物
• 4B050DD02 細菌，放線菌
• 4B050FF09 吸着クロマトグラフィー
• 4B050LL01 医薬（治療、予防）
• 4B050LL03 分析、診断
• 4B063QA18 物質の同定、微生物の同定
• 4B063QQ67 糖質、その構成成分、その誘導体
• 4B063QR15 糖質分解酵素　ＥＣ３．２．１．
• 4B064AF04 オリゴ糖類（糖類基を３～５個もつもの）
• 4B064AF11 多糖類
• 4B064CA21 酵素、酵素前駆体（ＦＷ）
• 4B064DA01 医薬；予防、治療
• 4B065AA01 細菌、放線菌
• 4B065AA57 菌類
• 4B065AA72 酵母
• 4B065AA87 動植物細胞または組織
• 4B065AB01 外来遺伝子が導入されたもの
• 4B065BA01 外来遺伝子の導入
• 4B065CA21 オリゴ糖
• 4B065CA22 多糖類
• 4B065CA31 加水分解酵素
• 4B065CA44 医薬（ヒト用）；医療
• 4B065CA46 診断、検査