幹細胞における腫瘍化原因細胞の新たな標識法と治療法

• 特願2014-004262 (2014.1.14) JP

• 小戝 健一郎
• 三井 薫
• 井手 佳菜子

• 国立大学法人鹿児島大学

ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、（１）創薬開発において薬物の毒性試験等に用いるヒト細胞、（２）発生・病態をｉｎ ｖｉｔｒｏで解明するために用いる疾患モデル細胞、（３）再生医療の移植用細胞等の医療・医薬創出の基盤ツールとして期待されている。最も期待される再生医療については、米国において一部の疾患に対してヒトＥＳ細胞を用いたヒト患者での臨床試験が既に開始されている。また、日本では、眼疾患に対するヒトｉＰＳ細胞を用いた臨床研究が開始されている。

ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の臨床応用における現在の最大の課題は、目的細胞へ分化させた後に残存する未分化細胞の混在である。分化誘導処理を行った細胞を移植した後、残存未分化細胞が奇形腫を形成することが報告されている（非特許文献１）。奇形腫は良性の腫瘍とはいえ、種々の副作用を生じる可能性が大きく、例えば、心臓に心筋細胞以外の細胞が移植された場合など、致死的不整脈などの重大な副作用を生じる可能性もある。

更に、分化した細胞を初期化するという人工的な修飾を加えたｉＰＳ細胞においては、奇形腫のみならず悪性腫瘍の発生も高度であるという報告がある（非特許文献２）。その原因として、ｉＰＳ細胞の樹立に必要な遺伝子の一つであり、癌原遺伝子としても知られるｃ－Ｍｙｃが活性化することで細胞が癌化すること、並びに、ｉＰＳ細胞の樹立においてレトロウイルスやレンチウイルスにより遺伝子が体細胞に導入されることにより、細胞の正常な機能を維持する上で重要な遺伝子（例えば、癌抑制遺伝子など）を破壊したり、細胞増殖に関連する遺伝子を異常に活性化させたりすることが考えられている。

よって、分化処理後の細胞中に残存する未分化細胞を効率的かつ網羅的に除去することにより、純化された分化細胞を取得する方法が求められている。これまで、ｃ－Ｍｙｃを除いた３因子でｉＰＳ細胞を樹立する方法（非特許文献３及び４）や、ウイルスベクターの代わりにプラスミドを用いてｉＰＳ細胞を樹立することで染色体の損傷を抑制する方法（非特許文献５及び６）が報告されている。しかし、これらはいずれも細胞の「腫瘍化」を抑制する一定の効果は期待できるものの、未分化細胞の残存を防ぐものではなく、また、例えば、移植後に逆分化した未分化細胞を除去できないという問題があった。

別のアプローチとして、分化させても腫瘍化しにくいクローンを選択して使用する方法が報告されている（特許文献１）。しかし、この場合にも、未分化細胞の残存を防ぐものではなく、また、腫瘍化を完全に抑制できるものではなかった。

また、残存未分化細胞を標的として殺傷する方法も検討されている。例えば、Ｎａｎｏｇプロモーターの下流に単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子を有するレンチウイルスベクターをマウスＥＳ／ｉＰＳ細胞やヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞に導入し、これらの細胞をガンシクロビル（ＧＣＶ）感受性とすることが試みられている。該細胞を免疫不全マウスの皮下に移植し、腫瘍を形成させた後、ＧＣＶを投与することで腫瘍が縮小することが報告されている（非特許文献７及び８）。

このようなＨＳＶ－ｔｋとＧＣＶの組み合わせによる自殺遺伝子治療法は、本発明のような再生医療における幹細胞の腫瘍化原因細胞の除去技術としては上記の一部の研究が発表された段階で、よって幹細胞の再生医療において臨床応用がなされた例は未だ全くない。その一方でＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶは、癌への遺伝子治療への応用としては長年の研究の歴史があり、ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ遺伝子治療（代表的なやり方は、ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子を導入・発現するウイルスベクターを患者の腫瘍内に直接注入した後に、ＧＣＶを患者さんに注射する）として癌患者へ臨床試験も既に数多く行われてきた実績がある。ＨＳＶ－ｔｋというヒト由来ではないウイルス由来の遺伝子を細胞に導入する場合は、異種蛋白に対する免疫の誘導が起こる可能性が示唆される。癌治療においては、ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が導入された癌細胞が細胞性免疫を中心とする免疫誘導により除去されることは治療効果の増幅に繋がるため、ウイルス由来の遺伝子という点はむしろ利点とも考えられる。しかし再生医療においては、移植細胞にＨＳＶ－ｔｋ遺伝子を導入した場合、異種蛋白に対する免疫誘導により移植細胞が除去されていく可能性も考えられるため、この点ではヒト由来の遺伝子を用いる方がより望ましいと推察される。他の戦略として、細胞増殖サイクルの抑制に働くｐ５３やｐ１６遺伝子をドキシサイクリンにより誘導して利用する技術も報告されている（特許文献２）。しかし、このような技術は、そもそも腫瘍抑制遺伝子は腫瘍細胞を積極的あるいは直接的に殺傷するものではないため腫瘍化細胞を全て死滅させることは不可能であることより、生存したまま残存した未分化細胞がドキシサイクリン誘導解除後に増殖を開始する可能性や、またいわゆるドキシサイクリンの遺伝子発現誘導システムは特異性が低いため非特異的にこれらの遺伝子が発現して幹細胞の分化誘導や生物的動態等に影響を及ぼしたりする可能性があるなど、効果・有用性の点では大きな問題があった。

一方、未分化細胞を識別する方法として、ＳＰ１（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）、カハールボディに含まれているタンパク質、核ラミナに含まれているタンパク質、傍核小体コンパートメントに含まれているタンパク質、又はＰＭＬボディに含まれているタンパク質の細胞核内の存在量等から識別する方法（特許文献３）や、ｈＴＥＲＴ遺伝子またはＩＰＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの発現の有無を調べることにより、細胞集団に含まれる形質転換細胞を検出する方法（特許文献４）、ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）を表面上に発現する細胞を同定する方法（特許文献５）が開示されている。しかし、これらの方法はいずれも煩雑な操作が必要であり、例えば、生体内に移植された組織内の残存未分化細胞を簡便に識別することはできなかった。

未分化細胞をそのプロモーター活性により識別することが試みられており、Ｓｔｍ１のプロモーター配列を利用する方法が開示されている。（特許文献６）

これまで、本発明者らは、多因子癌細胞特異的増殖制御型ウイルスを用いた残存未分化細胞の選択的殺傷方法を提供してきた（特許文献７）。該方法は腫瘍化細胞や未分化細胞を直接、積極的に殺傷する点、遺伝子が導入されていない腫瘍化細胞にも殺傷効果が及ぶ点等から本問題の解決に非常に有用である一方、あらかじめ全ての幹細胞に目的遺伝子を導入しているものではないため、よって多因子癌細胞特異的増殖制御型ウイルスが到達しなかった幹細胞から腫瘍化細胞が出現した場合に、生体内でこのウイルスへの免疫誘導全てを除去できるかまでは保証できなかった。

本発明は、幹細胞を分化させた後に残存する腫瘍化原因細胞の標識及び除去に用いるためのプロモーターの探索方法に関する。また、本発明は、幹細胞を分化させた後に残存する腫瘍化原因細胞の標識方法及び除去方法、並びに該方法に用いるためのウイルスベクターに関する。

• C12N  15/867     レトロウィルス・ベクター
• C12N  15/65      マーカーの使用
• C12Q   1/06      定量的な測定
• C12Q   1/6897  
• C12N   5/10      外来遺伝物質の導入によって修飾された細胞，例．ウイルス形質転換細胞

• 4B063QA01 定量、存否確認（ＦＷ）
• 4B063QA13 一次配列（例．塩基配列、アミノ酸配列）
• 4B063QA18 物質の同定、微生物の同定
• 4B063QQ02 高等動物（細胞、未分化細胞集団→ＱＱ０８）
• 4B063QQ03 体液、分泌液、排泄液（物）
• 4B063QQ08 動物の細胞、未分化細胞集団
• 4B063QQ42 ＤＮＡ
• 4B063QQ52 ＲＮＡ
• 4B063QR32 ＤＮＡ
• 4B063QR35 ＲＮＡ
• 4B063QR55 プローブ
• 4B063QR62 プライマー
• 4B063QS25 ＰＣＲ法
• 4B063QS32 検出用プローブの成分への結合
• 4B063QX02 発光、消光（例．蛍光、化学発光）
• 4B065AA90 動物細胞または組織
• 4B065AB01 外来遺伝子が導入されたもの
• 4B065AC20 その他
• 4B065BA01 外来遺伝子の導入
• 4B065BA02 ベクターを使用
• 4B065CA44 医薬（ヒト用）；医療
• 4B065CA46 診断、検査
• 4C084AA17 活性成分が１つのもの
• 4C084NA20 その他（＊）
• 4C084ZC41 機作で特定された医薬