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水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムを用いた定量的軟寒天コロニー形成アッセイ

国内特許コード	P150012030
掲載日	2015年6月15日
出願番号	特願2013-537523
登録番号	特許第5935141号
出願日	平成24年10月3日(2012.10.3)
登録日	平成28年5月20日(2016.5.20)
国際出願番号	JP2012075598
国際公開番号	WO2013051590
国際出願日	平成24年10月3日(2012.10.3)
国際公開日	平成25年4月11日(2013.4.11)
優先権データ	特願2011-219433 (2011.10.3) JP
発明者	古川龍彦
出願人	国立大学法人鹿児島大学
発明の名称	水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムを用いた定量的軟寒天コロニー形成アッセイ
発明の概要	本発明は、迅速に行うことができ且つ計測精度が高い定量的軟寒天コロニー形成アッセイを提供することを目的とし、具体的には、容器底面の寒天上に細胞を含む寒天を重層し、細胞を含む寒天の上部に培地を重層し、細胞を培養する工程と、培地を除去し、水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムと電子キャリアーとを添加し、細胞を培養する工程と、水溶性ホルマザンの発色を指標として細胞の生存を評価する工程とを含む、細胞の生存を評価する方法に関する。
従来技術、競合技術の概要	in vitroでのアッセイ系の確立は癌の研究の進歩を支えてきた重要な技術である。従来より、足場非依存性増殖は腫瘍性との高い相関性が知られており、足場非依存性増殖能の有無によって細胞の悪性形質転換が評価されてきた。軟寒天コロニー形成アッセイは、in vitroで比較的簡便に行える腫瘍形成能のアッセイである。軟寒天コロニー形成アッセイでは、ディッシュ上に軟寒天培地を分注し、当該軟寒天培地において細胞を培養させ、形成したコロニーを計数することで、細胞の増殖能を評価する。しかしながら、従来の軟寒天コロニー形成アッセイでは、寒天中で三次元に細胞が増殖することから定量化することが困難であった。これまで一般には細胞を染色することで半定量的に足場非依存的増殖能の有無が示されるに留まっている。そこで、軟寒天コロニー形成アッセイを定量化することで、より短時間で多検体を能率良く解析するスクリーニング法として確立することが望まれている。一方、例えばCytoSelect^TM96-Well In Vitro Tumor Sensitivity Assay (Soft Agar Colony Formation)(CELL BIOLABS, INC.社製)では、テトラゾリウム塩の1つであるMTT(3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)を使用して、軟寒天コロニー形成アッセイにおいて細胞の増殖能を定量化する。MTTは、黄色の水溶性溶液であり、生細胞内に取り込まれると細胞内のミトコンドリアの脱水素酵素により還元され、ホルマザンが形成される。当該ホルマザンは、青色の非水溶性結晶であり、生成後、沈殿する。沈殿したホルマザンをDMSO等の界面活性剤で溶解させると、赤紫色の溶液となり、当該溶液を吸光度で測定することで比色に基づいて細胞増殖能を定量化することができる。 CytoSelect^TM96-Well In Vitro Tumor Sensitivity Assayでは、具体的に96ウエル(穴)のマイクロタイタープレートにおいてボトムアガー上に、細胞を含む軟寒天を重層し、さらに当該軟寒天上に抗癌剤等の薬剤を含む培地を重層し、1週間程度培養する。培養後、寒天可溶化バッファーを添加することで寒天を可溶化する。可溶化した混合物を別の96ウエルのマイクロタイタープレートに移し、MTT溶液を添加し、2～4時間インキュベートした後、界面活性剤を添加し、再度2～4時間インキュベートする。次いで、マイクロタイタープレートリーダーで570nmにおける吸光度を測定する。しかしながら、MTTを使用した軟寒天コロニー形成アッセイでは、不溶性ホルマザンが形成され、界面活性剤の添加を必要とし、界面活性剤添加による泡立ちによって測定精度が低下するといった問題があった。また、培地を除かずに寒天可溶化バッファーを添加し、さらに可溶化した軟寒天細胞浮遊液の一部を用いるので、酵素反応系が希釈された条件となり、反応効率が低下し、データのばらつきが生じる虞がある。
産業上の利用分野	本発明は、例えば水溶性ホルマザンを生成することができるテトラゾリウムを用いた定量的軟寒天コロニー形成アッセイに関する。
特許請求の範囲	【請求項1】容器底面の寒天上に細胞を含む寒天を重層し、細胞を含む寒天の上部に培地を重層し、細胞を培養する工程と、培地を除去し、水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムと電子キャリアーとを添加し、細胞を培養する工程と、水溶性ホルマザンの発色を指標として細胞の生存を評価する工程と、を含み、寒天可溶化バッファー添加による寒天の可溶化及び界面活性剤添加による生成したホルマザンの溶解を行わない、細胞の生存を評価する方法。【請求項2】水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムが２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム・モノナトリウム塩である、請求項１記載の方法。【請求項3】電子キャリアーが１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェートである、請求項１又は２記載の方法。【請求項4】容器底面の寒天の濃度が０．５５～０．６５％である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。【請求項5】細胞を含む寒天の濃度が０．３５～０．４５％である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。【請求項6】容器底面の寒天上に癌細胞を含む寒天を重層し、癌細胞を含む寒天の上部に培地を重層し、癌細胞を培養する工程であって、癌細胞を含む寒天又は培地が候補抗癌剤を含有する、前記工程と、培地を除去し、水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムと電子キャリアーとを添加し、癌細胞を培養する工程と、水溶性ホルマザンの発色を指標として癌細胞の増殖を評価する工程と、を含み、寒天可溶化バッファー添加による寒天の可溶化及び界面活性剤添加による生成したホルマザンの溶解を行わない、抗癌剤のスクリーニング方法。【請求項7】水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムが２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム・モノナトリウム塩である、請求項６記載の方法。【請求項8】電子キャリアーが１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェートである、請求項６又は７記載の方法。【請求項9】容器底面の寒天の濃度が０．５５～０．６５％である、請求項６～８のいずれか１項記載の方法。【請求項10】癌細胞を含む寒天の濃度が０．３５～０．４５％である、請求項６～９のいずれか１項記載の方法。【請求項11】水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムと、電子キャリアーと、寒天とを含み、寒天可溶化バッファー及び界面活性剤を含まない、細胞生存又は細胞増殖評価キット。【請求項12】水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムが２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム・モノナトリウム塩である、請求項１１記載のキット。【請求項13】電子キャリアーが１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェートである、請求項１１又は１２記載のキット。
国際特許分類(IPC)	C12Q 1/04 微生物の存在または種類の決定；抗生物質または殺細菌剤の試験のための選択培地の使用；そのための化学指示薬を含む組成物
Fターム	4B063QA01 定量、存否確認（ＦＷ） 4B063QA18 物質の同定、微生物の同定 4B063QQ08 動物の細胞、未分化細胞集団 4B063QQ91 作用表現の物質（酵素等既出分は除く） 4B063QQ98 抗生物剤、殺生物剤 4B063QR58 発色（光）団を有するもの 4B063QR64 酸化、還元剤 4B063QR69 培地、培養基 4B063QR73 高等植物（細胞、未分化細胞集団→ＱＲ７８） 4B063QR78 植物の細胞、未分化細胞集団（←カルス） 4B063QS28 検出に有利、適切な物質への分解、転換 4B063QS39 特に工夫された器具、装置を利用するもの 4B063QX01 視覚的、光学的なもの（←発色、吸光度）
出願権利状態	登録