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ＩｇＹ特異的結合ペプチド及びそれによるＩｇＹの精製法

国内特許コード	P150012299
整理番号	S2014-0001-N0
掲載日	2015年9月9日
出願番号	特願2013-212343
公開番号	特開2015-073488
登録番号	特許第6245688号
出願日	平成25年10月9日(2013.10.9)
公開日	平成27年4月20日(2015.4.20)
登録日	平成29年11月24日(2017.11.24)
発明者	伊東祐二
出願人	国立大学法人鹿児島大学
発明の名称	ＩｇＹ特異的結合ペプチド及びそれによるＩｇＹの精製法
発明の概要	【課題】IgY特異的結合ペプチドを提供する。【解決手段】式： (X^1-3)-C-(X⁵)-W-(X^7-11)-W-(X¹³)-C-(X^15-17)（式中、X^1-3のうちX¹とX³、及びX^15-17は、独立に、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基であり、X²は、システイン残基であってもよい任意のアミノ酸残基であり、Cはシステイン残基であり、X⁵は、T、D、V、S又はEのアミノ酸残基であり、Wは、トリプトファン残基であり、X^7-11は、アミノ酸配列（S、T、R又はN）-(S、A、K又はR)-(I、A、V、T又はG)-(V、Y、T、R又はS)-(G又はD)であり、X¹³は、V、L、D、S、M、T又はRのアミノ酸残基である）によって表される、17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、4位と14位のシステイン残基間でジスルフィド結合を形成しており、並びに、トリIgYと結合可能であることを特徴とするペプチド、該ペプチドを使用するIgYの分析又は精製方法。【選択図】図２
従来技術、競合技術の概要	現在、臨床診断や研究用の試薬としての抗体は、マウスのモノクローナル抗体やウサギのポリクローナル抗体が多く使われており、大きな市場を持っている。一方、ニワトリのIgY抗体は、免疫による特異抗体作製方法の確立とともに、試験動物としてのコストの安さ、動物抗体との交差反応の低さに加え、卵黄から非侵襲的にIgYの抗体が精製できることがメリットとして注目され、試薬としての新しい抗体として期待されている。卵黄からのIgYの精製法として、いくつかの方法が報告されてきた（非特許文献1）。卵黄には、不溶性のリン脂質やリポプロテインが多く含まれており、これらがアフィニティ精製の際の障害となるため、これをPEG、Pectinなどを使った沈殿法によって除くプロトコールが報告されている（非特許文献2）。市販のIgY精製キットも同様な原理を用いたものであり、現在、主なもので、Eggcellent (Thermo Pierce) と EGGstract (Promega)がよく使われている。最近、Sock Hwee Tanらは、plant gums pectinとκ-carrageenanを用いた沈殿法で、市販のものとも、純度や収量で劣らない精製プロトコールを報告した（非特許文献3）。しかし、このような方法においても、精製されるIgYの純度は50～80%程度であり、より高精製度のIgYの調製には、アフィニティカラムの使用が不可欠である。しかしながら、例えば、ヒトIgGにおけるプロテインAのような、IgYを精製するための特異的なリガンドは、報告されておらず、精製用の合成リガンドが報告されているものの（非特許文献4、あるいはGE Healthcare社の2-mercaptopyridine固定化カラム：HiTrap IgY Purification HP）、精製されたIgY抗体の純度の観点からは、不十分（70％程度）と言わざるを得ない。本発明者らは、これまで、T7ファージディスプレイシステムによって構築したランダムペプチドライブラリを用いて、ヒトIgGやヒトIgAに特異的に結合するペプチドを単離し、そのペプチドを固定化したアフィニティカラムを使った抗体の精製法を報告してきた（特許文献1、2）。しかし、IgY結合ペプチドについては、これまで十分な報告がなかった。
産業上の利用分野	本発明は、IgY特異的結合ペプチドに関する。本発明はまた、該ペプチドによるIgYの精製法を提供する。
特許請求の範囲	【請求項1】下記の式(I)： (X^1-3)-C-(X⁵)-W-(X^7-11)-W-(X¹³)-C-(X^15-17) (I) （式中、X^1-3が、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列GVK、GTR、RCV、WIR、EWS、GTS、ATT、VNV及びGTWからなる群から選択され、 Cはシステイン残基であり、 X⁵は、T、D、V、S又はEのアミノ酸残基であり、 Wは、トリプトファン残基であり、 X^7-11は、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列SSIVD、SAAYG、TAVTG、TKVTG、RKTTG、NRGRG、TRGSG、RSGRG及びRRTSGからなる群から選択され、 X¹³は、V、L、D、S、M、T又はRのアミノ酸残基であり、並びに、 X^15-17は、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列VDM、YDY、RND、FAS、DRD、NTP、YSV、SKS及びGIGからなる群から選択される）によって表される、17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、4位のシステイン残基と14位のシステイン残基との間でジスルフィド結合を形成しており、並びに、トリIgYと結合可能であることを特徴とするペプチド。【請求項2】上記のX^1-3が、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列GVK、GTR及びRCVからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。【請求項3】上記のX^15-17は、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列VDM、YDY及びRNDからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のペプチド。【請求項4】上記のX⁵は、T、D又はVであることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチド。【請求項5】上記のX^7-11は、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列SSIVD、SAAYG、TAVTG及びTKVTGからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載のペプチド。【請求項6】上記のX¹³は、V、L又はDのアミノ酸残基であることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチド。【請求項7】以下のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項1～６のいずれか１項に記載のペプチド。 GVKCTWSSIVDWVCVDM（配列番号1） GTRCDWSAAYGWLCYDY（配列番号2） RCVCVWTAVTGWDCRND（配列番号3） WIRCDWTKVTGWVCFAS (配列番号4) EWSCVWRKTTGWSCDRD (配列番号5) GTSCSWNRGRGWMCNTP (配列番号6) ATTCTWTRGSGWSCYSV (配列番号7) VNVCEWRSGRGWTCSKS (配列番号8) GTWCTWRRTSGWRCGIG (配列番号9) 【請求項8】以下のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項７に記載のペプチド。 GVKCTWSSIVDWVCVDM（配列番号1） GTRCDWSAAYGWLCYDY（配列番号2） RCVCVWTAVTGWDCRND（配列番号3）【請求項9】標識が結合されている、請求項1～８のいずれか1項に記載のペプチド。【請求項10】請求項1～８のいずれか1項に記載のペプチドと連結されたタンパク質からなる融合タンパク質。【請求項11】請求項1～８のいずれか1項に記載のペプチドを固相に結合してなる固定化ペプチド。【請求項12】請求項1～８のいずれか1項に記載のペプチドをコードする核酸。【請求項13】請求項1～８のいずれか1項に記載のペプチド又は請求項１１に記載の固定化ペプチドをトリIgYと結合させること、並びに、結合したIgYを遊離させてIgYを回収することを含む、トリIgYの精製方法。【請求項14】請求項1～８のいずれか1項に記載のペプチド又は請求項１１に記載の固定化ペプチドにサンプル中のトリIgYを結合させ、結合したIgYを検出することを含む、トリIgYの検出方法。【請求項15】請求項1～８のいずれか1項に記載のペプチド又は請求項１１に記載の固定化ペプチドの少なくとも1種を含む、トリIgYの分析又は精製のためのキット。【請求項16】請求項１１に記載の固定化ペプチドを含有する、トリIgY分離用カラム。
国際特許分類(IPC)	C07K 7/08 アミノ酸を１２から２０個含有するもの C07K 19/00 ハイブリッドペプチド C07K 17/00 担体結合または固定化されたペプチド；その調製 C12N 15/09 組換えＤＮＡ技術 C07K 16/00 免疫グロブリン，例．モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体 G01N 33/53 免疫分析；生物学的特異的結合分析；そのための物質 G01N 33/531 免疫化学的試験物質の製造
Fターム	4B024AA11 分析、診断 4B024BA80 その他 4B024CA01 ＤＮＡ 4B024CA09 プローブ 4B024CA11 ＲＮＡ 4B024CA20 その他 4B024DA06 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） 4B024DA12 酵母 4B024EA04 プラスミド 4B024GA11 遺伝子、プラスミドの導入 4B024HA01 プロテインエンジニアリング 4B024HA08 遺伝子工学関連酵素 4B024HA11 分析、診断方法及び装置 4H045AA10 物質 4H045AA20 製造方法 4H045AA30 用途 4H045BA10 α‐アミノ酸の数 4H045BA17 １５～２３ 4H045BA32 Ｓ‐Ｓ結合 4H045BA41 融合蛋白質 4H045BA61 天然高分子 4H045CA01 ウイルス 4H045CA40 哺乳動物又は鳥類 4H045EA60 その他 4H045FA20 ペプチド結合の形成によるもの 4H045FA74 遺伝子組換 4H045FA80 固定化方法 4H045GA25 逆相クロマトグラフィー
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出願権利状態	登録

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発明の名称	IGY SPECIFIC BINDING PEPTIDE AND PURIFICATION METHOD OF IGY BY THE SAME
発明の概要	PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an IgY specific binding peptide. SOLUTION: The invention provides a peptide which comprises an amino acid sequence consisting of 17 amino acid residues represented by the formula: (X^1-3)-C-(X⁵)-W-(X^7-11)-W-(X¹³)-C-(X^15-17) (where X¹ and X3 among X^1-3, and X^15-17 are any amino acid residue except a cysteine residue independently, X² is any amino acid residue which may be a cysteine residue, C is a cysteine residue, X⁵ is an amino acid residue of T, D, V, S, or E, W is a tryptophan residue, X^7-11 are amino acid sequences (S, T, R, or N)-(S, A, K, or R)-(I, A, V, T, or G)-(V, Y, T, R, or S)-(G or D), X¹³ is an amino acid residue of V, L, D, S, M, T, or R); forms a disulfide bond between cysteine residues at positions 4 and 14; and can bind to tri IgY. The invention also provides an analysis or purification method of IgY using the peptide.

発明の名称

IGY SPECIFIC BINDING PEPTIDE AND PURIFICATION METHOD OF IGY BY THE SAME

発明の概要

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an IgY specific binding peptide.
SOLUTION: The invention provides a peptide which comprises an amino acid sequence consisting of 17 amino acid residues represented by the formula: (X^1-3)-C-(X⁵)-W-(X^7-11)-W-(X¹³)-C-(X^15-17) (where X¹ and X3 among X^1-3, and X^15-17 are any amino acid residue except a cysteine residue independently, X² is any amino acid residue which may be a cysteine residue, C is a cysteine residue, X⁵ is an amino acid residue of T, D, V, S, or E, W is a tryptophan residue, X^7-11 are amino acid sequences (S, T, R, or N)-(S, A, K, or R)-(I, A, V, T, or G)-(V, Y, T, R, or S)-(G or D), X¹³ is an amino acid residue of V, L, D, S, M, T, or R); forms a disulfide bond between cysteine residues at positions 4 and 14; and can bind to tri IgY. The invention also provides an analysis or purification method of IgY using the peptide.

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