新規なＤＮＡメチル化解析方法

• 特願2010-098163 (2010.4.21) JP

• 横山 勢也
• 米澤 傑

• 国立大学法人鹿児島大学

エピジェネティクス（Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）とは、ゲノムでは規定されない遺伝子発現の制御機構を明らかにしようとする、遺伝学又は分子生物学の研究分野である。当該エピジェネティクスを支える主要な分子機構がＤＮＡのメチル化である。ＤＮＡメチル化は、化学的に安定であり、ＤＮＡ配列自体に変化を加えることなく、細胞分裂を通じて伝達される情報である。このようなＤＮＡメチル化の特性により、ＤＮＡメチル化は、例えば組織特異的な遺伝子発現、刷り込み、Ｘ染色体の不活性化、癌化等の様々な現象において重要な役割を担っていると考えられている。近年では、ＤＮＡメチル化酵素遺伝子やＤＮＡメチル化状態の異常に起因する先天的又は後天的疾患、クローン動物におけるＤＮＡメチル化の異常等が既に多数同定されている。
従来において、ＤＮＡメチル化を解析すべく様々な方法が存在する。種々のＤＮＡメチル化解析方法は、解析感度、網羅性、解像度、定量性等において異なる特徴を有し、目的に応じて適宜選択される。例えば、特定の遺伝子の転写抑制機構を明らかにする場合には、１塩基レベルの解像度が必要となる。一方、メチル化の頻度を解析する場合には、定量性や精度も考慮しなければならない。
特定領域におけるメチル化ＤＮＡの検出では、重亜硫酸塩（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）処理による塩基置換反応を行い、ＤＮＡの配列を決定する。当該塩基置換反応では、非メチル化シトシンが重亜硫酸ナトリウムと反応して、ウラシルへと変換される。メチル化シトシンは重亜硫酸ナトリウムと反応しないので、原理上全てのシトシンのメチル化状態を塩基の違いとして検出できる。従来における検出方法としては、例えばＰＣＲを使用したメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、定量的ＰＣＲを使用したＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＭＳＰ法、ＴＡクローニングを使用したＢｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、質量分析を使用したＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、次世代ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用したパイロシークエンス法等が挙げられる。さらに、重亜硫酸塩反応を必要としないＩＣＯＮ－ｐｒｏｖｅ法も開発されている。
目的タンパク質やマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）の発現量は個々のＣｐＧメチル化の程度のみでは判別が難しく、その特定領域のメチル化パターンや連続性が重要となる。ＣｐＧメチル化程度を検出する方法として様々な方法が開発されているものの、そのパターンや連続性を検出する方法としては、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法のみである。
一方、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ＤＧＧＥ法は、ＡｂｒａｍｓとＳｔａｎｔｏｎ（非特許文献１）によって提案された変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法を基本とし、Ｐ．Ｇｕｌｄｂｅｒｇ等（非特許文献２）によって開発された方法である。当該方法では、重亜硫酸塩処理後のサンプルをＰＣＲによって増幅した後、そのアプリコンを、ポリアクリルアミドと変性剤の濃度勾配から成るゲルを使用した電気泳動に供する。ポリアクリルアミドの濃度勾配に基づき二本鎖ＤＮＡの分子量の違いによる分離を行い、さらに変性剤の濃度勾配に基づき二本鎖ＤＮＡの変性度の差異による分離を行い、目的領域中のウラシル（非メチル化シトシン）とシトシン（メチル化シトシン）の違いによる分離が行われる。当該方法は、ＭＳＰ法と同様に視覚的評価を行うことができ、さらに、電気泳動後のゲル中のバンドをシークエンス反応に転用することができる。また、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法と比較すると、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ＤＧＧＥ法によれば大幅な時間短縮を行うことができる。
しかしながら、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ＤＧＧＥ法では、重亜硫酸塩処理後にＰＣＲによる増幅を行うため、非メチル化シトシンがチミンに変換され、もとからＤＮＡ配列に存在するチミンと混在するため類似した配列が増加することとなる。当該増加に伴い、ＰＣＲにおいてミスアニーリングが生じやすく、ＰＣＲのサイクル数を上げると、非特異的アンプリコンが増幅されてしまうこととなる。微量サンプルの解析やマイナーなＤＮＡメチル化パターンの検出を行う際には、ＰＣＲのサイクル数を上げることが必須であり、その結果、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ＤＧＧＥ法によると、解像度の低下が生じる。また、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ＤＧＧＥ法は、電気泳動ゲルの作製に、ポリアクリルアミドと変性剤の二つのグラジエントを必要とする。そのため、確認したい標的を変更する場合に、ゲルの最適化を検討する必要があり、大変煩雑である。

本発明は、例えば、ＤＮＡメチル化パターン及び連続性等のＤＮＡメチル化を検出する方法に関する。

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