超音波による卵子またはクローン胚の活性化方法ならびに該方法により活性化したクローン胚からのクローン動物の作出

• 三好 和睦
• 吉田 光敏

• 国立大学法人　鹿児島大学

卵巣から排卵された卵子は、第２減数分裂中期で休止している。精子が卵子に侵入すると卵細胞質内におけるカルシウムイオン濃度が一時的に増加し、これが引き金となって減数分裂が再開される。この現象は卵子の活性化と呼ばれている。卵子の活性化は、人為的な刺激によって誘起することも可能であり、人為的活性化は顕微授精胚や核移植胚のような通常の受精以外の方法で作出された胚の発生を開始させるために必須である（非特許文献１）。人為的活性化法としては、各種化学物質で処理することにより、卵細胞質内におけるカルシウムイオン濃度の上昇あるいはＭ期促進因子の活性低下を促進させる方法（非特許文献２から４）と、電気パルスの印加により卵細胞膜に一時的に孔を開け、そこからカルシウムイオンを流入させることにより、卵細胞質内カルシウムイオン濃度を上昇させる方法がある（非特許文献５および６）。体細胞核移植によるクローン動物の作出においては、化学物質での処理が効果的でないことから、電気パルスの印加が広く用いられてきた（非特許文献７および８）。しかし、クローン動物の作出は低い値にとどまっており、電気パルスの印加に替わる新しい活性化法が望まれていた。

最近になって超音波を用いた遺伝子導入法が開発された。超音波による遺伝子導入のメカニズムはまだ完全に解明されていないが、超音波エネルギーにより発生する直径１～100μｍのミクロの気泡が関与していると推測されている。細胞外においてこれらの気泡の複雑な物理運動が発生し、細胞膜の透過性を促進する。また、時速600km以上の速さを持つ液体マイクロジェット流が気泡の周囲に発生し、これらが細胞膜に突き刺さるように衝突した際に一時的な孔が出現して細胞膜付近にある遺伝子が細胞内に取り込まれると考えられている。従来は、卵子の活性化と同様に、細胞に電気パルスを印加して細胞膜に一過性の孔を開けることにより、細胞内に遺伝子を導入するエレクトロポレーション法が多く用いられてきたが、超音波導入法はエレクトロポレーション法と比較して、細胞に与えるダメージの少ないことが示唆されている。

本発明者らは、先に超音波を照射することによってブタ卵子の活性化を誘起し得ることを明らかにした（非特許文献９および特許文献１）。
しかしながら、効率的な活性化を誘起する超音波照射条件は解明されてなかった。

体細胞核移植によるクローニング技術は、優良家畜の増産や遺伝子資源の保存に利用できる。さらに遺伝子を改変した体細胞を用いることにより、遺伝子改変動物を作出することも可能である。特にミニブタにおいては、臓器移植用のドナーとして用いるために、免疫反応を制御した遺伝子改変細胞に由来するクローンブタの作出が期待されている。しかしその作出効率は依然低く、改善すべき点も多い。近年、体細胞や受精卵を用いて、クローン動物を作出するためのクローン胚を作出する方法が開発されている（特許文献２および３）。クローン動物の作出のためには、核移植細胞を活性化し、発生を誘起させる必要があるが、発生の誘起には、主に電気刺激を用いて、クローン胚を活性化しているが、効率的なクローン動物の作出については依然報告されていない。

【特許文献１】
特開2005-210981号公報
【特許文献２】
特表2003-513673号公報
【特許文献３】
特表2002-511234号公報
【非特許文献１】
Robl JM et al., New York Academic press (1992) pp535-551
【非特許文献２】
Funabashi H et al., Biol Reprod (1994) 50:1072-1077
【非特許文献３】
Mayes MA et al., Biol Reprod (1995) 53:270-275
【非特許文献４】
Machaty Z et al., Biol Reprod (1998) 59:451-455
【非特許文献５】
Hagen DR et al., Mol Reprod Dev (1991) 28:70-73
【非特許文献６】
Kim NH et al., Biol Reprod (1996) 54: 1397-1404
【非特許文献７】
Onishi A. et al, Science (2000) 289:1188-1190
【非特許文献８】
Polejaeva IA et al., Nature (2000) 407:86-90
【非特許文献９】
Sato et al., Mol Reprod Dev (2005) 72:396-403

本発明は、動物卵子およびクローン細胞の超音波処理による人為的活性化法ならびに該人為的活性化法を用いたクローン動物の作出法に関するものである。

• C12N   5/073     胚細胞または組織；胎児細胞または組織
• C12N   5/10      外来遺伝物質の導入によって修飾された細胞，例．ウイルス形質転換細胞
• C12N  13/00      微生物または酵素の電気または波動エネルギーによる処理，例．磁気，音波
• A01K  67/02      脊椎動物の繁殖

• 4B033NG05 細胞
• 4B033NH04 培養促進，活性化
• 4B033NJ05 超音波
• 4B065AA90 動物細胞または組織
• 4B065BC50 その他
• 4B065BD50 その他