免疫組織化学的染色による抗原の検出方法

• 蓮井 和久
• 村田 長芳

• 国立大学法人　鹿児島大学

近年の免疫科学の進歩により、抗原抗体反応を用いて微量の物資を感度良く検出する免疫測定が広く用いられている。免疫測定の中で一般的なものとして、免疫組織染色及び酵素免疫測定がある。

免疫組織染色とは、組織上の特定の抗原を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する方法である。通常、組織を固定後パラフィン包埋したブロックから薄切した切片上に特定の抗原を認識する抗体を反応させ、反応した抗体の有無から抗原の存在を判断する。最初に抗原と反応させる抗体を、通常、一次抗体と呼ぶ。一次抗体に、視覚又は機器により検出し得るシグナルを発する物質を結合させておけば、そのシグナルの強度から一次抗体の量がわかり、それは即ち切片上の抗原の量に対応する。この目的を達成するためのシグナルを発する物質として蛍光物質、酵素などが挙げられる。

光学顕微鏡での染色像の解析が可能となった現在では、シグナルを発する物質として酵素を用いるのが一般的となった。免疫組織染色を行なう際、一次抗体に酵素を結合させておけば、その酵素の発色性の基質を加えることにより酵素活性に対応した発色が得られ、それは抗体の量に対応、即ち組織上に存在する抗原の量に対応する。しかし、この方法では通常十分な感度が得られない。

抗原を検出する免疫組織化学的染色方法には、一次抗体を可視化できる酵素や標識物で標識したものを用いる直接法と一次抗体を標識せずに二次抗体を標識する間接法があることは知られている[例えば、非特許文献1(2002(平成14)年2月18日)、pp.23-25参照]。一般に、間接法には、抗原を一次抗体で標識した後に、この特異抗体を標識する間接法に属するペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ法(以下、PAP法という)、ストレプトアビチン-ビオチン複合体法(以下、sABC法という)、二次抗体と標識酵素とをポリマーへ結合させたポリマー試薬法、フルオレセインイソチオシアネート(以下、FITCという)で標識した一次抗体ないし二次抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ(以下、HRPということがある)標識抗FITC抗体を用いる方法、sABC法に異化レポーター沈着反応(以下、CARD(catalyzed reporter deposition)反応という)を追加した超高感度の免疫組織化学的染色方法がある。

PAP法は、非特許文献1に記載されている。これには、ウサギの一次抗体を反応させ、次ぎに、過剰なブタ抗ウサギ抗体を反応させる方法である(非特許文献1、pp.136-138)。ブタ抗ウサギ抗体の2つのウサギ抗体に対する結合部の一つに、ウサギ抗ＨＲＰ抗体とＨＲＰを可溶性結合させた複合体(PAP複合体)を抗原抗体反応で結合する。HRPと過酸化水素水とジアミノベンチジン(以下、DABということがある)等のカップリング色素で抗原の存在部位に呈色反応を生じさせる。ヘマトキシリン溶液で核を対比染色した後に、濃度の漸増するエタノール系列に切片を浸し脱水し、キシレンを浸透させ、カバーガラスでプラスチック溶剤を用いて封入する。

sABC法は、非特許文献1に記載されている(そのpp.138-144)。この方法によれば、固定組織パラフィン切片のパラフィンを除去し、0.03%過酸化水素水メタノール液に20分間浸し内因性ペルオキシダーゼ活性を抑制し(そのp.163に記載)、リン酸緩衝液で親水化する。切片中の抗原を一次抗体で標識する。ビオチン化二次抗体を一次抗体と反応させ、ストレプトアビチン-HRP複合体で標識し、HRPと過酸化水素水とジアミノベンチジン等のカップリング色素で抗原の存在部位に呈色反応を生じさせる。ヘマトキシリン溶液で核を対比染色した後に、濃度の漸増するエタノール系列に切片を浸し脱水し、キシレンを浸透させ、カバーグラスでプラスチック溶剤を用いて封入する。

また、HRP標識抗FITC抗体を用いる方法が知られている(非特許文献1、p.158)。これによれば、sABC法と同様に固定標本切片を親水化し、FITC標識の一次抗体で抗原を標識するか、抗原と反応させた一次抗体をFITC標識二次抗体で標識し、そのFITCをHRPなどの酵素で標識した抗FITC抗体と反応させ、HRPなどの呈色反応で、抗原の検出を間接的に行う。商業的なこのキットが知られている(例えば、非特許文献2(online)(平成15年2月17日検索)、ザイメッド社のホームページ参照)。

また、ポリマー試薬法が知られている[例えば、特許文献1(株式会社ニチレイ、2001(平成13)年7月3日、酵素-タンパク質複合体参照)]。特許文献1では、ポリマーを担体として酵素(HRPなど)と抗体(蛋白)の複合体で、高感度に特異抗体で標識される物質の検出が可能との記載がある。特許文献1の請求項13に、ポリマー試薬法の記載がある。また、非特許文献1のp.147に、以下に示すポリマー試薬法の実施法の記載がある。sABC法と同様に固定標本切片を親水化し、切片中の抗原を特異抗体と反応させ、二次抗体とHRP等の酵素とポリマーの複合体と反応させ、HRPなどの呈色反応で、抗原の検出を間接的に行う。商業的には、EnVision(エンビジョン)、ChemMate EnVision(ケムメイト・エンビジョン)がダコサイトメーション社(DakoCytomation Co.)から、simple stain system(シンプル・ステイン・システム)が株式会社ニチレイから、特異抗体と酵素とポリマーの複合体を用いるEPOS system(エポス・システム)がダコサイトメーション社から供給されている。

また、CARD反応が知られており[例えば、特許文献2(Bobrow, et al.(ボブラウ等)、March 24, 1998(平成10年3月24日)、Catalyzed reporter deposition(異化レポーター沈着：CARD反応))参照]、特許文献2では、claim 9(クレイム9)に、ビオチン化タイラマイドや蛍光標識(FITC等)タイラマイドの利用の記述があり、ビオチン化タイラマイドのCARD反応の記載がある。酵素反応での特異物質の沈着を特定の物質の検出の増幅に用い、超高感度の検出が可能であることは知られている[非特許文献1のp.150-152、及び例えば、非特許文献3(1989(平成1)年12月20日)参照]。また、化学固定された組織のパラフィン切片で、抗原回復処理と非特許文献1記載の標識シグナルの増幅法の組み合わせ[ImmunoMax(イムノマックス)法]で、化学固定された組織のパラフィン切片では検出できなかった抗原を検出することができることは知られている[例えば、非特許文献4(1995(平成7)年7月)参照]。非特許文献3及び非特許文献4に、超高感度の免疫組織化学的染色法の以下に示す実施法の記載がある。すなわち、sABC法と同様に固定標本切片を親水化し、抗原回復し、sABＣ法で抗原を標識し、HRPによるビオチン化タイラマイドを沈着させ、ストレプトアビチン-HRP複合体で標識増幅を行い、抗原の検出感度をsABC法の1000倍に増幅する超高感度の免疫組織化学的染色を行う方法である。この染色方法はImmunoMax法として報告され、商業的にはcatalyzed signal amplification (CSA、カタライズド・シグナル・アンプリフィケーション)systemとしてダコサイトメーション社より供給されている。しかし、抗原回復による内因性ビオチンによる非特異反応は強く、非特許文献1のp.164-165に記載の内因性ビオチンを0.1%アビチン溶液と0.01%ビオチン溶液に浸しマスクする方法を導入したものが開発された。そして、modified ImmunoMax(修飾イムノマックス)法が開発された[例えば、本発明者等による非特許文献5(1997(平成9)年)及び非特許文献6(2000(平成12)年)参照]。また、sABC法の代わりに、HRP標
識二次抗体を用い、HRPによるFITC標識タイラマイドを沈着させ、HRP標識抗FITC抗体で標識増幅する超高感度の免疫組織化学的染色方法がキット化され、非ビオチン法のCSAIIとしてダコサイトメーション社から供給されている。さらに、標的核酸を標識するin-situ hybridization(インシトゥ・ハイブリダイゼーション)の増幅したシグナルを可視化する方法として、HRP、アルカリフォスファターゼなどの酵素反応の他に、蛍光標識(FITC等)が利用できることは知られている[例えば、特許文献3(Goldberg, et al.(ゴールドバーク等)、March 20, 2001(平成13)年3月20日、Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays(特定の結合アッセイにおける検出可能な信号増幅の為の方法及び組成物)参照)]。特許文献2のclaim 9と特許文献3にCARD反応での沈着したタイラマイドの標識に、蛍光物質を使う記載がある。

また、免疫組織化学的染色における非特異反応は、目的とする抗原以外の非特異的結合物質によって、目的とする抗原の適切な検出を妨げるという問題を有する。

このような非特異反応には、固定組織標本切片に内在する原因によるものと、固定組織標本切片の処理に起因するものと、染色の各反応の試薬の問題、染色の各反応後の洗浄の問題、染色操作の問題が原因となるものとがある。

このような非特異的反応による問題を解決するために、内因性ペルオキシダーゼ活性による非特異反応の抑制方法が知られている(非特許文献1の前述のp.163)。内因性ペルオキシダーゼ活性による非特異反応は、固定組織標本切片の内在する原因による非特異反応の一つである。内因性ペルオキシダーゼ活性の抑制は、固定組織標本パラフィン切片のパラフィンを除き、切片を、親水化の前に0.03%過酸化水素メタノール溶液に20分間浸すか、親水化後に0.3%過酸化水素リン酸緩衝液に5分間浸して行なう。

抗体の非特異反応は、前述の染色の各反応の試薬の問題、染色の各反応後の洗浄の問題による非特異反応に含まれる。これらの染色に関わる非特異的反応の問題に対して、断片化免疫グロブリン抗体を特異(一次)抗体や二次抗体に用いることで、非特異反応を抑制することが知られている[例えば、特許文献4(Tsao, et al.(ツァオ等)、February 9, 1999(平成11)年2月9日、Immuno-histochemical method that reduces background staining(バックグラウンド染色を減少させる免疫組織化学的方法)参照)。また、特異抗体反応前に一価の抗体を反応させることで、抗体の非特異反応を抑制できることが知られている(特許文献4及び非特許文献1のp.43)。また、抗体希釈液に一次抗体と対応したウマ、ヒツジ、ウサギなどの動物血清を1%から5%加えることで非特異反応を抑制することは知られている(非特許文献1のp.185)。抗体希釈液には、0.1%Tween(トゥイーン)20等の界面活性剤を添加したトリス緩衝液が商業的に供給され用いられている。また、0.25%カゼイン溶液を抗体反応の前に5～30分間反応させることで非特異反応抑制することは知られている(非特許文献1のp.115)。

抗原回復法による非特異反応は、固定組織標本切片の処理に起因するものであるが、超高感度の免疫組織化学的染色法で問題となる。その主たる原因が抗原回復された内因性ビオチンである。0.1％アビチン溶液で、内因性ビオチンをマスクし、アビチンの残余ビオチンとの結合部を0.01%ビオチン溶液でマスクする方法の知られている(非特許文献1の前述のp.164-165)。この方法を、sABC法を含む超高感度の免疫組織化学的染色方法に導入することも知られている(非特許文献5)。非特許文献5には、非特許文献2記載のImmunoMax法で、内因性ビオチンによる非特異反応があり、従来発表されているアビチン溶液とビオチン溶液でのビオチンのマスクを導入し、反応後の洗浄条件を変えることで、超高感度免疫組織化学染色が可能であるとの記載がある。非特許文献6には、HRPによるビオチン化タイラマイドの沈着反応による標識の増幅が1000倍であること、内因性ビオチンのマスク法の超高感度免疫染色法への至適導入部、各超高感度免疫組織化学染色の反応後の洗浄、後固定の非特異反応抑制条件等の記載がある。

免疫組織化学的染色法の洗浄液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、界面活性剤を加えたトリス緩衝液が用いられる。免疫組織化学的染色では、各反応後に、5分間3回の洗浄が行われる。非特許文献5と非特許文献6に、超高感度免疫組織化学的染色方法では、それに含まれるsABC法では充分な反応後の洗浄が必要であり、CARD反応のビオチン化タイラマイドの沈着は非特異なものであるので、非沈着ビオチン化タイラマイドの残留を除く洗浄と沈着ビオチン化タイラマイドのHRP標識ストレプトアビチンによる標識後のある程度の洗浄が必要になることの記載がある。また、非特許文献5と非特許文献6に、キャピラリーギャップ法の染色装置を用いた場合には、sABC法の充分な洗浄は35℃に加熱した界面活性剤を加えたトリス緩衝液で、HRPによるビオチン化タイラマイド沈着反応後は室温トリス緩衝液での洗浄が必要であるとの記載がある。

一方、免疫組織化学的染色法の基準化の為に、自動免疫染色装置が普及してきている。キャピラリーギャップ法と呼ばれる2枚の固定組織標本切片のスライドグラスを向き合わせ、その間に毛細管現象を利用して反応液や洗浄液を吸い上げ、反応ないし洗浄後に吸収材で溶液を吸収する。この操作をコンピューター制御するものである。また、コンピューター制御で、反応液や洗浄液を所定の場所からマイクロポンプで吸引し、水平に配置した固定組織標本切片のスライドグラスに反応液や洗浄液を滴下する滴下型がある。この滴下型の自動免疫染色装置の染色方法は用手法と同じもので、普及して来ている。更に、加熱温度制御の出来る基盤の上に、基盤に固定組織標本切片を対面させてスライドガラスをセットし、反応液や洗浄液を基盤とスライドガラスの間に送り、温度制御下で諸反応と洗浄を行う自動免疫装置も出現している。

自動免疫染色装置は、コンピューター制御下の装置で、組織化学的染色方法を実施するものである。組織標本の切片を貼付したスライドの装置へのセットの方法で、二枚のスライドを狭い間隙で重ね、その間に毛細管現象で反応試薬等は入ってくるキャピラリーギャップ法とその変法、スライドに反応試薬等を滴下する滴下型がある。また、免疫組織染色方法の各反応の時間、各反応後の洗浄の方法等をコンピューターのプログラムとして供給されているものと、各反応の試薬の各スライドへの分配、各反応の時間、各反応後の洗浄方法を、任意に設定できるものがある。前者は、特定の免疫組織化学的方法を実施するもの(固定型装置)であり、一般に、その試薬や洗浄液等が共に供給されることが多い。後者は、その使用者の設定した免疫組織化学的染色法を実施させることが可能なもの(自由型装置)がある。コンピューター制御による水平に配列したスライドへの滴下方式での自動免疫染色装置は知られている[例えば、特許文献5(Rhett, et al.(レット等)、February 19, 2002(平成14年2月19日) Method and apparatus for automatic tissue staining(自動組織染色の為の方法及び機器)参照)]。特許文献5には、この自由型装置の記載がある。また、抗原回復を加熱式攪拌装置での熱処理による抗原回復法と従来発表されているアビチン溶液とビオチン溶液でのビオチンのマスクを導入した超高感度免疫染色法(CSA法)の自動免疫染色装置での実施が可能であることは知られている[例えば、非特許文献7(2001(平成13)年3月)参照]。非特許文献7には、この自動免疫染色装置での超高感度の免疫組織化学的染色が可能であると記載されている。加熱温度制御の出来る基盤の上に、基盤に対応する面に固定組織標本切片が来る形でスライドグラスをセットするか、又は基盤に対面して固定組織標本切片のスライドガラスをセットし、反応液や洗浄液を基盤とスライドグラス(ガラス)の間に送り、温度制御下で諸反応と洗浄を行う自動免疫装置(The Ventana Discovery(ザ・ベンタナ・ディスカバリー))は知られている[例えば、非特許文献8(online)(平成15年2月17日検索)参照]。

【特許文献１】
特開2001-181299号公報
【特許文献２】
米国特許第5,731,158号明細書
【特許文献３】
米国特許第6,203,989号明細書
【特許文献４】
米国特許第5,869,274号明細書
【特許文献５】
米国特許第6,349,264号明細書
【非特許文献１】
名倉宏、長村義之、堤寛編、「渡辺・中根 酵素抗体法」、改訂四版、学際企画、2002(平成14)年2月18日発刊、p.23-25、p.43、p.115、p.136-138、p.138-144、p.147、p.150-152、p.158、p.163、p.164-165、p.185
【非特許文献２】
ザイメッド社のホームページ(http://WWW.zymed.com/)、“NBA kit(非ビオチン法のキット)”のページ、［online］、［平成15年2月17日検索］、インターネット〈URL：http://WWW.zymed.com/pindex/index9.html〉
【非特許文献３】
Bobrow(ボブロウ) MN, Harris(ハリス) TD, Shaughnessy(ショーネシー) KJ, Litt(リッツ) GJ. Catalyzed reporter deposition(異化レポーター沈着), a novel method of signal amplification(信号増幅の新しい方法). Application to immunoassays(免疫アッセイへの適用). J-Immunol-Methods.(Journal of Immunological Methods)、1989 Dec. 20(平成1年12月20日); 125(1-2): pp.279-85
【非特許文献４】
Merz(メルツ) H, Malisius(マリシウス) R, Mannweiler(マンワイラー)S, Zhou(チョウ) R, Hartmann(ハートマン) W, Orscheschek(オルシェチェク) K, Moubayed(モーベイド) P, Feller(フェラー) AC (1995)、“ ImmunoMax.(イムノマックス.)、Amaximized immunohistochemical method for the retrieval and enhancement of hiddenantigens.(隠された抗原の回復及び増強用の最大化された免疫組織化学的方法.)” LabInvest.(Laboratory Investigation)、The United States and Canadian Academy of Pathology. LWW, Lippincott Williams and Wilkins publishes(リピンコット・ウイリアムズ・アンド・ウィルキンス出版社) 1995 Jul.(平成7年7月);73(1): pp.149-56.
【非特許文献５】
蓮井和久(Hasui K), Sato(サトウ) E, Tanaka(タナカ) Y, Yashiki(ヤシキ) S, Izumo(イズモ) S.(1997)、“Quantitative highly-sensitive immunohistochemistry(Modified ImmunoMax) of HTLV-1 p40tax and p27rex proteins in HTLV-1-associated non-neoplastic lymphadenopathy(HANNLA) with estimation of HTLV-1 dose by polymerase chain reaction(HTLV-1関連非腫瘍性リンパ節腫脹(HANNLA)におけるHTLV-1 p40Tax及びp27Rexタンパク質のポリメラーゼ連鎖反応法によるHTLV-1用量の推定を伴う定量的高感度免疫組織化学(修飾イムノマックス)).” 、DENDRITIC CELLS、1997(平成9年)、Japanese Dendritic Cell Society(日本樹状細胞研究会)、7: pp.19-27
【非特許文献６】
蓮井和久、“平成10年度～平成11年度科学研究費補助金(基盤研究(C)(2))研究成果報告書HTLV-1関連疾患のHTLV-1超高感度組織化学的検出法による研究(課題番号10670166)”、2000(平成12)年3月、pp.3-9
【非特許文献７】
Hashizume(ハシヅメ) K, Hatanaka(ハタナカ) Y, Kamihara(カミハラ)Y, Tani(タニ) Y.、“ Automated immunohistochemical staining of formalin-fixed andparaffin-embedded tissues using a catalyzed signal amplification method(触媒化信号増幅法を用いるホルマリン固定化及びパラフィン-包埋化組織の自動免疫組織化学染色).”Appl-Immunohistochem-Mol-Morphol.(Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology)、2001 Mar(平成13年3月); 9(1): pp.54-60
【非特許文献８】
Ventana Medical Systems, Inc.、“ The Ventana Discovery”、［online］、［平成15年2月17日検索］、インターネット〈URL： http://WWW.ventanadiscovery.com/product/index.html〉

本発明は、抗原の検出方法に関し、特に、免疫組織化学的染色を用いた抗原の検出方法に関する。

• G01N  33/53      免疫分析；生物学的特異的結合分析；そのための物質
• G01N  33/48      生物学的材料，例．血液，尿；血球計
• G01N  33/543     免疫化学物質を固定化するための不溶性担体によるもの
• G01N  21/78      色の変化の提示

• 2G045BB14 洗浄
• 2G045BB25 染色剤に特徴を有するもの
• 2G045CB01 細胞、組織
• 2G045FA16 顕微鏡を用いるもの
• 2G045FB01 酵素学的なもの
• 2G045FB03 免疫学的なもの
• 2G045FB12 ケイ光法によるもの
• 2G045GC15 発光量、ケイ光量
• 2G054AA08 組織、細胞
• 2G054AB03 酵素分析　酵素名（Ｆ）
• 2G054AB04 免疫分析、抗原抗体の検出
• 2G054BB08 染色　染料名（Ｆ）
• 2G054CE02 蛍光試薬、発色試薬　試薬名（Ｆ）
• 2G054EA03 蛍光分析、りん光分析
• 2G054GE03 スライド型